Naegleria fowleri and Acanthamoeba spp. are free-living amoebas that are widely distributed in natural environments. Although uncommon, infection with these protozoans can cause fatal disease in humans and animals. In this study, in order to select the appropriate method to survey Naegleria fowleri and Acanthamoeba spp. in water samples, four molecular biology techniques and one commercially available kit for real-time PCR were compared. The results indicated that the duplex real-time PCR was the most sensitive, and could be used to simultaneously detect two different free-living amoebas. Using the duplex real-time PCR approach, the two free-living amoebas were surveyed in three local streams in Daejeon, Republic of Korea. The concentrated free-living amoebas were inoculated onto non-nutrient agar plates which had been spread with heat-inactivated E. coli and incubated for 5-7 days. After incubation, gDNA was extracted and used as the template for amplification by duplex real-time PCR. Acanthamoeba spp. and N. fowleri was detected from ten (83.3%) and two (16.6%) of the twelve samples, respectively. As these two free-living amoebas can be fatal, continuous surveillance is needed to track their distribution in the aquatic environment for the drinking water safety