It has been known that Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri are free-living amoebas (FLA) widely distributed in environments and cause diseases that result in serious infection to humans infrequently. Lots of researchers have been detected FLA in various water environments. It is necessary to investigate the existence of these amoebas in aquatic environment in order to secure the safety of drinking water sources. In our previous studies, a duplex real-time PCR method was set up for detecting FLA in water. This study investigated two different free-living amoebas, Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri, in raw water on a trial basis. In this study, a total of 12 different raw water samples were collected from three major streams in Daejeon Area. Filtration and centrifugal processes were applied to concentrate these raw water samples, and the pellets were inoculated on non-nutrient agar (NNA) plates. Then, it was incubated at 30°C for 5~7 days. Then, the total genomic DNA was extracted and analyzed using the duplex real-time PCR. In the results, Acanthamoeba spp. were detected in 83% (10 out of 12) of samples whereas 25% (3 out of 12) of water samples were positive for N. fowleri. Although we analyze only 12 water samples, our result showed that N. fowleri is not as common as Acanthamoeba spp. To identify the distribution of FLA in raw water in more detail and to secure the public water safety in Korea, further surveys should be continuously conducted