Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri are free-living amoebas (FLA) widely distributed in natural environments and are associated with some severe diseases in humans. In our previous study, we set up a duplex real-time PCR method to detect FLA in water. In this study, we investigated two kinds of FLA, Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri, in raw water samples. A total of 12 samples of raw water were collected from three major streams in Daejeon. For each stream, two different samples were collected in twice. The raw water samples were filtered and concentrated by centrifugation, and the final pellet was inoculated on non-nutrient agar plates and incubated for 6 days at 30°C. Then, the total genomic DNA was extracted and analyzed using the duplex real-time PCR method. Ten out of the twelve samples (83%) contained Acanthamoeba spp. and three samples (25%) were positive for N. fowleri. Although the number of analyzed smples (n=12) were not much, our results showed that N. fowleri is not as common as Acanthamoeba spp. To identify the distribution of FLA in raw water in more detail and to secure the public water safety in Korea, further surveys should be conducted.