Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri are the most common free-living amoeba (FLA) associated with human diseases. Although several researches about FLA have been done clinically, there have been rare studies of water environments. Although there have been rare fatal cases in Korea, recently, some fatal cases have been reported in neighboring countries including Japan, Taiwan, and etc. Therefore, the necessity of investigating FLA in national water has been proposed in recent years. For achieving it, first of all, reliable and effective detection methods of FLA in water are needed. In this study, we conducted four kinds of molecular methods, real-time PCR, PCR (or nested PCR), LAMP, and duplex real-time PCR, in order to detect FLA in water and compared them to choose the most sensitive detection method. Then, we found that the real-time PCR assay is the most sensitive method. To detect FLA in raw water, the sample water was filtered and centrifuged. Also, the pellet was inoculated on non-nutrient agar and incubated for 5 to 7 days at 30°C. The plates were examined using a microscopy to morphologically identify two different kinds of FLA. Following a genomic DNA extraction process, the duplex real-time PCR method was conducted. We finally identified that the duplex real-time PCR method to detect Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri simultaneously is the most effective method in water.