Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri are free-living amoebas (FLA) widely distributed in natural environments and are associated with some severe diseases in humans. In our previous study, we set up a duplex real-time PCR method to detect FLA in water. In this study, we investigated two kinds of FLA, Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri, in raw water on a trial basis. A total of 6 samples of raw water were collected from three major streams in Daejeon. For each stream, two different samples were collected. The raw water samples were filtered and concentrated by centrifugation, and the final pellet was inoculated on non-nutrient agar plates and incubated for 5 to 7 days at 30°C. Then, the total genomic DNA was extracted and analyzed using the duplex real-time PCR method. As a result, in Yoodeung stream, Acanthamoeba spp. were detected in both of two water samples. In Gap and Daejeon streams, Acanthamoeba spp. were detected in one sample each. Any Naegleria fowleri was not detected in all six samples in this time. To identify the distribution of FLA in raw water in detail, and to secure the public water safety, further surveys should be conducted.