Objective To simultaneously detect viable Cryptosporidium parvum oocysts and Giardia duodenalis cysts and reduce analysis time and cost, Methods A duplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method was newly developed. Results Using duplex RT-PCR method for the hsp70 gene, viable (oo)cyst concentrations of 101 and 103 (oo)cysts/100 μL could be detected for C. parvum and G. duodenalis, respectively. However, after heat-shock stimulation the expression of hsp70 mRNAs was detectable at 100 and 101 (oo)cysts/100 μL concentrations of C. parvum and G. duodenalis, respectively. Thus, the detection sensitivity was significantly increased when the viable (oo)cysts were exposed to heat shock. Conclusion This study describes a new duplex RT-PCR method for hsp70 gene to detect the viable (oo)cysts of the C. parvum and G. duodenalis with less time and lower cost. This newly developed duplex RT-PCR method may be used to detect these parasites not only in aquatic environments but also in clinical samples.