Membrane is used for the separation of anolyte and catholyte, by allowing proton and ion transfer between two chambers in microbial fuel cells (MFCs). Even though there has been rapid development for the membranes in chemical fuel cells, there are still remaining barriers such as proton transfer limitation and oxygen diffusion, which decrease the MFC performance by increasing internal resistance and reducing cell voltage. Therefore, alternative membranes optimized for MFC operation need to be developed to overcome the current limitations and increase power output. Several membranes like CMI, CEM, Nafion-117, and cellulose, PP 80, PP 100, PPS, Nylon mesh, polyester mesh, were tested in order to understand how they affect the MFC performance in terms of ion transport, pH balance, oxygen diffusion, and power generation, the internal resistance of MFC also less with CEM 306 Ω. The CEM membrane had shown highest voltage generation 450 mV, maximum power density (135 mW/m2) and less oxygen diffusions (Kom = 9.8 x10-4, Dom = 2.6 x 10-6) compared to nafion, CMI and cellulose. The PP80 showed the highest proton transport (KHm = 1.2 x 10-4 cm/s) compared to other membranes.