We prepared monoclonal antibodies specific to the H1N1 2009 virus (H1N1 2009) to facilitate development of a rapid diagnostic test (RDT) with enhanced sensitivity and specificity. Among these antibodies, we identified two clones?hybridomas 1H7E1 and 3A3H7?that specifically bound to H1N1 2009 (non-seasonal) and were very suitable for application to a diagnostic kit. The affinity constants (Ka) of 1H7E1 and 3A3H7 were 1.10 × 1010 and 2.35 × 1010, respectively. To identify the antibodies, we performed enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot analyses and found that 1H7E1 recognized a conformational epitope of hemagglutinin while 3A3H7 recognized a linear epitope. In clinical evaluations using specimens from 215 patients, a lateral flow rapid testing kit comprising these monoclonal antibodies showed a sensitivity of 81.5% (75/92) and a specificity of 96.7% (119/123). Results using the RDT kit were well correlated with conventional reverse-transcriptase PCR methods as commonly and commercially used. Based on our findings, we believe that use of these monoclonal antibodies with a rapid evaluation kit could serve as a good diagnostic tool for H1N1 2009.