To confirm the microbiological safety of drinking water, it is very important to survey the waterborne microbial pathogens. Recently, matrix-associated laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been introduced for bacterial identification and its wide use has been expected in near future. However, it has not yet been evaluated for use in the identification of bacteria in the aquatic environmental samples. To our knowledge, it is the first study where the MALDI-TOF MS and MALDI Biotyper software database has been applied to identify the waterborne microbial pathogens. Seven bacteria (Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Yersinia enterolitica, Legionella pneumophila, Shigella sonnei, Campylobacter jejuni, and Staphylococcus aureus) were selected from the list of priority microorganisms in Korean Ministry of environment, contamination candidate list 3 in United States-Environmental Protection Agency, guideline for drinking-water quality in World Health Organization, and Australian drinking water guideline, and it was shown that MALDI-TOF mass spectrometry identification of them had good correlation with 16S rDNA identification. In conclusion, this study suggests that MALDI-TOF based identification method was reproducible and accurate with low costs and rapid time.