Albeit many methods have been developed and widely used for the clinical detection of human rotaviruses (HRVs), there are few methods to detect HRVs in aquatic environments. To rapidly and conveniently detect infectious waterborne HRVs that cause diarrhea in infants and children, we have developed an integrated cell culture (ICC) real-time reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) using MA104 cells. The ICC real-time RT-PCR can detect HRV with a sensitivity of up to 1.99 TCID50/mL. This detection sensitivity is similar to those of cytopathic effect (CPE)-based methods such as the total culturable virus assay. Further, while CPE-based methods are labor-intensive and time-consuming and can only provide qualitative analysis of waterborne viruses, the ICC real-time RT-PCR method is advantageous because it is highly specific for HRVs, is quantitative, and has a shorter detection time, that is, of approximately 4~5 days. In conclusion, this study proposed the use of ICC real-time RT-PCR for the detection of HRVs; this method can also be applied for HRV detection in aquatic environments.