To understand how human cytomegalovirus (HCMV) might change and evolve afterreactivation, it is very important to understand how the nucleotide sequence of culturedHCMV changes after in vitro passaging in cell culture, and how these changes affect thegenome of HCMV and the consequent variation in amino acid sequence. Strain JHC of HCMVwas propagated in vitro for more than 40 passages and its biological and genetic changes weremonitored. For each passage, real-time PCR was performed in order to determine the genomecopy number, and a plaque assay was employed to get virus infection titers. The infectiousvirus titers gradually increased with passaging in cell culture, whereas the number of virusgenome copies remained relatively unchanged. A linear correlation was observed between thepassage number and the log10 infectious virus titer per virus genome copy number. Tounderstand the genetic basis underlying the increase in HCMV infectivity with increasingpassage, the whole-genome DNA sequence of the high-passage strain was determined andcompared with the genome sequence of the low-passage strain. Out of 100 mutations found inthe high-passage strain, only two were located in an open reading frame. A G-T substitution inthe RL13 gene resulted in a nonsense mutation and caused an early stop. A G-A substitution inthe UL122 gene generated an S-F nonsynonymous mutation. The mutations in the RL13 andUL122 genes might be related to the increase in virus infectivity, although the role of themutations found in noncoding regions could not be excluded.