Mitochondria often play central roles in apoptotic pathways, and disruption of themitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) has been observed in various cells undergoingapoptosis. Human cytomegalovirus (HCMV) infection induces apoptosis in permissive cells;however, investigations of mitochondria-targeted apoptosis in HCMV-infected humanforeskin fibroblast (HFF) cells have been limited. Here, we investigated the mitochondrialapoptosis pathway in HCMV-infected HFF cells. Flow cytometry analysis using JC-1 revealedthat HCMV infection induces disruption of ΔΨm in HFF cells when administered 24 h postinfection(hpi), and this disruption was maximized at 48 hpi. Moreover, cytochrome c,normally a mitochondrial inner membrane protein, was detected in cytoplasmic extracts ofHCMV-infected cells, but not mock-infected cells, by western blot analysis at 24 hpi. A caspaseactivity assay based on fluorescence spectrophotometry using a fluorogenic substrate revealedan increase in caspase-3 activity at 48 hpi in HCMV-infected cells. Caspase-8 activity wasincreased at 72 hpi in HCMV-infected cells. These results imply that HCMV infection inducesmitochondria-mediated apoptosis in HFF cells.